其他內(nèi)容：

酶聯(lián)免疫測定技術(shù)的多酶級聯(lián)放大系統(tǒng)：

一、AP底物放大系統(tǒng)

substrate ampiification system

AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1)，以乙醇作還原劑，在醇脫氧酶催比下，乙醇脫氫，NAD+還原為NADH，NADH在黃遞酶的催 化下脫氫，同時四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan)。AP不斷催化NAD+生成，NAD+與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化，不斷 生成甲蠟。整個反應(yīng)周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級聯(lián)，每個AP分子每分鐘可催化生成6X104個NAD+分子，而每個NAD+每分鐘又可使60個 甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年shou次報道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測定敏感性提高約250倍。

但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對整個酶級聯(lián)反應(yīng)有抑制作用，影響放大效果，而當(dāng)加入鹽酸氨基脲時，則可進(jìn)一步延長反應(yīng)循環(huán)，從而增加 測定敏感性，這是因?yàn)辂}駿氨基脲可與乙醛反應(yīng)生成縮氨基脲(semicarbatone)和水，這樣就消除了乙醛對反應(yīng)的抑制阼用。應(yīng)用這種改進(jìn)方法測定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌，測定敏感性從Self原方法的(4～6)X103菌落形成單位(c．{．u)/g或m1，到20個菌落形成單位 (c．f．u)/g或ml，測定敏惑性約提高200—300倍。

后來Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來放大模式中的四唑鹽，刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin，然后使用熒光比色計(jì)測定得到結(jié)果。這種方式的測定敏感性也較原始方法大為提高，每孔內(nèi)僅含約350個AP分子也可測出。

二、雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)

dual-enzyme cascade雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級聯(lián)放大系統(tǒng)，酯酶抑制劑4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團(tuán)，對酯酶不具抑制活性，但 當(dāng)其在AP作用下脫—PO4基時，失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑，使加入的羧酸酯酶失活，通過顯色反應(yīng)測定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性，二者 成反比相關(guān)。這種放大系統(tǒng)的測定敏感性較普通方法可提高約125倍。

三、酶激活級聯(lián)放大系統(tǒng)

enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標(biāo)記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD，FAD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成H2O2，于是在DCHBS，4AAP及HRP存在下，得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測定l{mol/LAP。

此外，催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition，CARD)也是一種多酶級聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素 標(biāo)記的酪胺所產(chǎn)生的游離基，可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應(yīng)而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內(nèi)，沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標(biāo)記的鏈霉親合素測定，沉著的熒光素則可用酶標(biāo)抗熒光素測定。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標(biāo)記物，從而大為改善(約30倍)EIA 的測定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標(biāo)物測定AFP，不但提高了測定敏感性，而且也使背景“噪 聲"較普通方法改善了6～8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒，在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下，可 將試劑盒的測定敏感性提高約5倍。

四、凝固因子酶級聯(lián)放大系統(tǒng)

脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可激活鱟血細(xì)胞裂解物的凝固級聯(lián)反應(yīng)。首先LPS使因子C激活為C，后者又激活因子B為B，B使 前凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶，凝固酶則催化底物(Boc-Le，u-Gly-Arg-p)產(chǎn)生有色的對硝基苯胺(曠 nitroa·niline，PNA)，A405nm測定。因此，在免疫測定中，如以LPS作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，則可通過上述反應(yīng)使測定敏感性放大，可檢 出10-7～10-11g／m1的IgG和10-7～10-11g／ml的抗IgG，Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測HBsAg，敏感性達(dá) 10-10～10-12g／ml。

五、免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)

一般來說，在酶免疫測定中，限制測定敏感性的一個重要因素是非特異地結(jié)合于固相的標(biāo)記酶的顯色反應(yīng)，因其會使背景顯色加深，從而掩蓋了低濃度待測物所致的 特異顯色，解決這個問題提高測定敏感性的一條途徑是將待測物——抗體—酶復(fù)合物從固相上洗提至另一個固相，使用一雙標(biāo)抗體[如生物素和*(DNP) 標(biāo)記的抗體]和一酶標(biāo)抗體即可達(dá)到這個目的，在液相中形成的免疫復(fù)合物(雙標(biāo)抗體：抗原：抗體：酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上，洗滌后，使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來，然后再將上述免疫復(fù)合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上，最后進(jìn)行酶反應(yīng)顯色測定。Hashida和 shikawa使用該方法測鐵蛋白敏感性達(dá)到1zeptomole(1X10-21mol，約600個分子)，較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該 方法測定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過常規(guī)方法，取得了良好的效果。

此外，Domingo和Marco等在進(jìn)行點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)時，以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物，反應(yīng)后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結(jié)果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而非可見光下能見到的最終產(chǎn)物，所以可大幅度地提高這種固相免疫測定的敏 感性，較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificat*tem)，也是一種新型高效的EIA測定放大 系統(tǒng)。

綜上所述，EIA測定放大方式雖然多種多樣，且不斷推陳出新，但研究者的出發(fā)點(diǎn)無非是一方面極力降低影響測定敏感性的非特異顯色，如通過 增加操作步驟而達(dá)到上述目的的免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)；另一方面則是通過質(zhì)量提高的信號，從而達(dá)到提高敏感性的目的，如增加反應(yīng)層次的生物素—親 合素，多酶級聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴(yán)格地講，真正稱得上是EIA測定放大系統(tǒng)的僅限于后者，前者還只能說是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應(yīng)產(chǎn)物特征改變檢測手段(如發(fā)光或熒光檢測)而使EIA測定敏感性提高，則只不過是依靠儀器開闊了“視野“而已。